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2024年6月2日日曜日

スーパー初心者のためのオリゴ核酸合成入門:RNAの化学合成は何故チャレンジングなのか?

ども、居酒屋大好きなボッチ星人のコンキチです。
ということで、駅ナカの小洒落た居酒屋で一人呑みしてきたときのメモです。


-ぬる燗佐藤 御殿山茶寮 memo-

住所:港区高輪3-26-27 エキュート品川2階

-紀土 山田錦50 純米大吟醸 90 ml (540 JPY, visited Dec. 2016)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
常温で提供されたです。
吟醸香は華やかでフルーティー。柔らかくて優しい香り(吟醸香が鼻につくタイプではなくて良き)。 
テイストも香り同様柔らかく、優しい立体的な膨よかさを感じる。 
常温の大吟醸でこれは凄いと思う。惚れた。



-酒盗 (540 JPY, visited Dec. 2016)-
-RATING- ★★★☆☆
-REVIEW-
塩辛い味付けで酒のアテにベストマッチ(酒がすすむ)。
普通に旨い。







-美丈夫 特別本醸造 180 ml (1,080 JPY, visited Dec. 2016)-
-RATING- ★★★★☆
-REVIEW-
お湯を張った木の箱の中に入ったチロリの中の酒が入っている(この状態で提供)。チロリを湯からあげた際に底の湯を拭くための布巾が付いてくるのが心憎いです。
酒質は燗上がりするタイプだと思う。
仄かに昇温由来と思われる滋味を感じて、口に含んで喉に流し込む一連の所作が楽しくなる味。 
提供温度域は上燗程度か? 
落ち着いた味で、食中酒として良いと思いました。 

-からすとんび (432 JPY, visited Dec. 2016)-
-RATING- ★★★☆☆
-REVIEW-
タコ・イカの顎ないしは顎板(くつばし、くちびる)。
弾力に富み、(けっこう)噛み切りやすい。比較的淡白な味ながら、噛むほどに味(タコ・イカ様、特に加熱したイカ様)が染み出る。 
一粒一粒が食べ易く、酒のツマミに良い。 


-大山鶏もも肉の柚子胡椒塩焼き (1,080 JPY, vsited Dec. 2016)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
ジューシーでむっちり軟らかく、塩加減が良い塩梅。滋味深く美味しいですよ。 







-赤武 新生酒 F NEWBORN (702 JPY, visited Dec. 2016)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
「究極のキレ」がウリのようです。
ボク的にはキレはあまり感じなかったけど、独特の不思議な味わいは何とも形容し難く、とっても美味しい。 





-じゃこ入り芝浦玉子焼き (626 JPY, visited Dec. 2016)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW- 
物凄く旨い! 味が濃厚。
玉子の味、お出汁の味、具材の味の融合が怒涛の旨さとなって押し寄せる。
また食べたいリピート必至の一品。


-ちょい飲みセット (2,000 JPY, visited Sep. 2024)- 
お好きな日本酒一種+料理四種"のセット。 
-青森 陸奥八仙 特別純米 【漁火】-
-RATING- ★★★☆☆
-REVIEW-
 冷や(常温)でいただく。
青森県産華吹雪を全良使用のお酒で、米の甘みや旨味を残しつつ、やや辛口タイプに仕上げたといいます。
ひんやりとした甘い香り(少し鼻につくか)の淡麗辛口。滑らかな舌触りで、とても柔らかい酒質。落ち着いた膨よかさを感じる。
ボク的には食中酒向きのイメージ。 

-〆鯖-
-RATING- ★★★☆☆
-REVIEW- 
〆加減が繊細で美味しい。
欲を言えば、もう少し潤いが欲しいい。
 山葵は粗めにおろされていて超フレッシュで甘味も感じる。これが〆鯖にベストマッチ! 

-梅水晶-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW- 
梅の味付けはマイルドめで上品な仕上がり。
大葉の陰に大根おろしが隠れている。 
普通に文句なく旨い。 

-明石たこチャンジャ-
-RATING- ★★★☆
-REVIEW- 
こちらもかなりマイルド。 
上品で普通に美味しい(蛸はちょっぴり)。 

-えいひれ- 
-RATING- ★★★★★
-REVIEW- 
旨くて驚いた。 
場末の酒場にありがちな苦手な気の抜けた様なぼやけた甘さが殆どない。
乾物の旨味が濃縮。そして、えいひれらしいライトな甘さ。
そのまま食べて十分美味しんだけど、マヨネーズで旨さがワンランクアップ。 

 
-じゃこ入り芝浦玉子焼き (750 JPY, visited Sep. 2024)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW- 
ちょいゴワの玉子焼きの舌触りが堪らない。 
玉子の旨味が溢れてる。
お出汁のしっかりした味(濃いめ)リッチ。
上品旨い滋味がじゃこからも滲み出ているのか。
絶品。 

 -ザ・モルツ【瓶】 (580 JPY, visited Sep. 2024)- 

-特別本醸造 美丈夫【燗】180 cc (1,200 JPY, visited Mar. 2024)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
ミルキーかつフルーティーな香味。
甘酸っぱい味わいで呑み口が良い。
いい感じの辛口。 





-目鯛刺身 (900 JPY, visited Mar. 2024)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
大振りに切り出された目鯛の身はしっとりした舌触り。
素朴な淡白さを醸す旨さ。 
山葵はフレッシュで辛味が鼻に抜ける。


-播州一献 超辛口 90 cc (550 JPY, visited Mar. 2024)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
柔らかい口当たり。微弱なミルキーノート。上品な辛さ。そして、米の柔らかい酸味。
ホント美味しいんだけど、「超辛」ではなくね?





-カンパチカマ焼 (900 JPY, visited Mar. 2024)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
これは旨い!
身の張りが良く、ホロホロと崩れる食感が心地いい。
脂の溜まった軟らかい部分も美味しい。
薄味で上品な旨味がたっぷり。
レモンで味が映える。
たっぷりの大根おろしにお醤油を垂らして、しょっぱさを調整して味わうのがいいと思いました。


日本酒を注文すると、その都度日本酒カードが付いてくるサービスが心憎い。
場所柄、お上品な店だったです。 


閑話休題


前回、オリゴデオキシリボブクレオチド(オリゴDNA)の化学合成をメモしました(http://researcher-station.blogspot.com/2024/02/blog-post.html)。
今回はオリゴRNA合成のメモです。


一般的に、RNAはDNAとは異なり高いpH領域で不安定で、その性質がRNA合成を難しいものにしているといいます。
なので、2'位の水酸基は、オリゴヌクレオチド合成中は元より塩基性条件下でホスホジエステルと核酸塩基を脱保護する際、2'位の水酸基は保護されていなければなりません。
バックボーン・クリベージとバックボーン・マイグレーションがその要因ですね。

ということで、2'位の水酸基はシリル基で保護されることになり、鎖長を伸長させた後、固相担体の切断と核酸塩基の脱保護を行い、最後にシリル基の除去を行うことでオリゴRNA合成が完結します(TBAFかTEA•3HFで脱保護します)。

最も一般的の用いられる2'水酸基の保護基はTBDMS基ですね(例えば、2022年に報告された名古屋大学の阿部先生のグループの200塩基からなるRNAの完全化学合成ではTBDMS基が使われています(論文には書いてなくて、口頭でそう言ってました)。ACS Chem. Biol., 2022, 17, 1308-1314. http://researcher-station.blogspot.com/2022/11/rna.html)。
あと、高額になりますがTBDMSよりもいいTOM (2'-O-TriisopropylOxyMethyl)という保護基があります。

TOMの利点は二つあって、一つは、シリル基周りの立体障害がTBDNSより空いていることから、カップリング効率がTMDNSに比して向上します(2'-OMeと同等の反応性という報告もあります)。
もう一つは、塩基性条件下における核酸塩基の脱保護工程における安定性です。
TBDMS保護では2' to 3' マイグレーション (バックボーン・マイグレーション)が起こり得ますが、TOM保護ではそれが抑制されるといいます。

特にアンモニア水中におけるスタンダードなDNAの脱保護条件では、TBDMS基が脱落しやすいです。従って、RNA合成における脱保護はよりマイルドで迅速に行わなければなりません。
ということで、核酸塩基の保護基をより除去しやすいものに変えてやって、穏和な条件で脱保護してあげるのがオリゴRNA合成には効果的です。具体的には保護基を次のものに変えてあげます↓

核酸塩基の保護基をベンゾイルからフェノキシアセチルやアセチルに変えるんですね(アミダイトモノマーの値段は高くなりますが)。

このように、除去しやすい保護基を導入することで、より温和な反応条件(脱保護条件)を適用することが可能になります。例えば、AMA (conc. NH3 aq./40% MeNH2 aq. =50/50)、conc. NH3 aq/EtOH (3:1)、K2CO3 in MeOH、EMAM (ethanolic MeNH2/MeNH2 aq.=50:50)などでしょうか。

このように、塩基性条件下で安定な2'水酸基の保護基、除去しやすい核酸塩基の保護基、温和な脱保護条件の適用といった三位一体のコンボで、効率的なRNA合成ができるというお話でした。

以上、役に立つかどうか分かんないけど、二流大出のテクニシャン(研究補助員)のオリゴRNA合成メモでした。

2024年2月11日日曜日

スーパー初心者のためのオリゴ核酸合成入門:再考ホスホロアミダイト法

プレ・コロナの時代に池袋の美久仁小路にある昼は定食屋、夜は居酒屋なお店に行ったときのメモです。

-ずぼらmemo-
住所:豊島区東池袋1-23-11 美久仁小路 小野ビル1F 

-焼魚定:鯖 (800-discount 50=750 JPY, visited Apr. 2019)- 
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
ごはん・味噌汁・小鉢・おしんこ(小)付。 
水金曜日は定食50円引き。 
鯖は嫌味なところが全く、マイルドなフィッシーノート(fishy note)は綺麗でさえあり、最高に食欲を掻き立てられる。
身はフカフカ、ホクホクな膨らみのある食感でとってもジューシー。塩味は控えめで、軽やかな脂の旨さと、上品で力強い鯖の香味がふんだん。 
脇に添えられている大根おろしに醤油を少し落として鯖の身に載せ、ご飯と一緒に掻きこむのが至福。 
味噌汁は、しじみ、豆腐、わかめから選択できて、今回は蜆をセレクト。
底に沢山の蜆が沈んでいて、その風味がとっても濃厚。 
いんげんの胡麻和え(小鉢)は軟らかく、優しい味付け(筋が少しあるのはご愛嬌)。 


-ビール (瓶) キリン(大) (600 JPY+tax, vsited Jun. 2019)-
ラガー。 

-お通し (多分300 JPY+tax, visited Jun. 2019)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
酢の物。 
オクラとモズクがとってもフレッシュ! 
山芋の千切りも入ってる。 
お酢の風味の円やかさが絶妙。 




-煮込み (400 JPY+tax, visited Jun. 2019)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW- 
味噌仕立ての煮込みで、王者の風格漂う味わい。 
モツは味が染みていて軟らかく、スナックライクな食感もあって絶妙な食べ心地。 
お豆腐は絹と木綿が混在しているような感じ。 
お味噌仕立てのツユは五臓六腑に染み渡る旨さ。
丁度いい塩梅の味付けで、味噌汁的ニュアンスを感じました。 


-桜えびかき揚げ (400 JPY+tax, visited Jun. 2019)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
衣は軽やかで、桜えびは滋味深い香味でフレッシュ。 
何も付けずに食べると、口の中で甘味が拡散する。
マイルドな味の粗塩を振って食べると、キュッと味が締まる。 
シャクッとした玉葱とクニッとした桜えびの食感の融合が心地いい。 
ビールによく合います。

このお店は昭和29年(1954年)創業で、美久仁小路の最古参らしいです。


閑話休題


やっぱり流行ってそーだぜー、オリゴ(デオキシ)ヌクレオチド。
その合成法は定番のホスホロアミダイト法で、以前簡単にメモしました↓

富士フイルム和光純薬のウェブサイト(和光純薬時報)でも、佐藤健太郎さんが解説記事を書いています↓

佐藤さんの記事はとても分かり易くためになる記事なのですが、ボクなりに多少視点を変えてメモしてみました。

ハイ、ホスホロアミダイト法 の合成サイクルを示す定番の画です↓


A:活性化とカップリング、B:キャッピング、C:酸化、D:脱トリチル化のサイクルを繰り返し、望みの鎖長に達したら、E:樹脂からの切り出しとリン酸基と核酸塩基の保護基を脱保護(脱固相担体・脱保護)することで目的のオリゴ核酸(VI)を取得します。
それでは、サイクルに各工程について見ていきましょう。

まず、「A:活性化とカップリング」のステップです。

固相担体に結合した(オリゴ)核酸とヌクレオシドホスホロアミダイトとの反応です。
まず、ホスホロアミダイトがプロトン化され、次いでテトラゾールがジイソプロピルアミノ基と置換します。その後、5'-位の水酸基と反応するわけですが、5'-水酸基のプロトン化されたホスホロアミダイトへのダイレクトアタックのメカニズムも考えられます。
あと、ヌクレオシドホスホロアミダイトはプロトン化することで活性化(不安定化)するので、一般論として乾燥個体の状態で保管しておけばかなり安定です。

あと、活性化剤の酸性でホスホロアミダイトモノマーの脱トリチルが起こってしまい、その結果n+1の不純物を副生する懸念があることから、強すぎない酸性と良好な溶解性に加えて高い求核性を有するDCIが教科書的には推奨されています。だけど、活性化剤の選択にはプロセス最適性とか好みとかもあるんじゃないかと思います。


因みに、試薬グレード(TCI)だと、
1H-tetrazoke:24,600 JPY / 25 g
ETT:9,900 JPY / 5 g
BTT:15,000 JPY / 25 g
DCI:13,300 JPY / 25 g, 68,400 JPY / 250 g
ですね。


次に「B:キャッピング」工程です。


NMI、無水酢酸、ピリジンのアセトニリル溶液でキャップ化を行うと思うんですが、もっぱらNMIが未反応の5'-水酸基のアセチル化を触媒し、ピリジンは脱トリチル化を抑制する働きをします。
基本的なことなんですが何故キャップ化を行うかというと、通常n-1の不純物が最も分離し難いわけで、毎サイクルキャップ化することで(n-1)-merの副生を抑制できるから重要なんですね。


次に続くは「C:酸化」です。

カップリング工程で生成する亜リン酸トリエステル(P(III))は酸に対して不安定で、酸にさらされる前に安定なP(V)に変換しなければなりません。
なので、酸を使う脱トリチル化の前に酸化(P(III)→P(V))を終えておく必要があります。
あと、脱トリチル化後に酸化を持ってくると、5'-水酸基が酸化される懸念もゼロではないかもと思いました。


酸化が終わったら、次のサイクル(カップリング)に向けた「D:脱トリチル化」です。


ジメトキシトリチルカチオンは鮮やかなオレンジ色なので、自動合成装置に組み込まれているUV検出器でモニターすることで、しっかり脱保護することができます。


A、B、C、Dのサイクルを繰り返して望みの鎖長まで伸長させたら、最後は「E:脱固相担体・脱保護」です。
樹脂を伴ったスクシンユニット、リン酸基の保護基であるシアノエチル基、核酸塩基の保護基を切断します。
オリゴDNAの反応では濃アンモニア水を55˚Cで作用させるのがスタンダード。脱樹脂とシアノエチル基の脱保護が核酸塩基の脱保護に先んじて起こります。
上の画では、核酸塩基の保護基の脱保護が55℃ではじめて起こるかのように描いてありますが、これは程度の問題で核酸塩基の保護基は室温で全く起こらないといわけではなくて、室温でも長時間反応させればかなり外れます。
核酸塩基の保護基の中では、グアニンのイソブチリル基が外れにくくって、イソブチリル基を切断するために長時間加熱していると分解してしまうような修飾核酸を組み込んでいる場合は、脱保護され易いジメチルホルアミジジル基 (dmf)で保護するのがポピュラーです。

以上がオリゴデオキシリボヌクレオチド(オリゴDNA)のホスホロアミダイト法の反応サイクルです。

ところで、なにも修飾していないないオリゴ核酸は体内でヌクレアーゼ(核酸分解酵素)によってリン酸ジエステル結合が切断されて分解してしうまうことが問題なのですが、核酸を修飾してやるとヌクレアーゼ耐性が向上します。核酸の化学修飾は、リン酸部の修飾、糖部の修飾、塩基部の修飾に分類され、リン酸部の酸素原子(O)を硫黄原子(S)に置換したホスホロチオアート修飾(S化)がよく知られていて、SオリゴとかS化オリゴと呼ばれています。

Sオリゴの合成法は上述したホスホロアミダイト法の酸化反応を硫化反応に変えることで達成されるんですが、ただ一点注意が必要で、キャッピングの前に硫化を行わなければまりません。カップリングが終わったらキャッピングをする前に硫化を行うということです。

というのも、キャッピング反応条件下で三価のリン((P(III))が酸化されるからと言います(このことのが書いてある論文があったら教えてください)。
参考のため硫化剤としてPADSとEDITHを使った場合の反応機構もメモしておきます↓

PADSはピリジンと一緒に使うんですが、効率よく硫化するためのコツがあって、PADSとピリジンをアセトニトリルに溶かして二日以上寝かした(エージングした)試薬を使うと硫化率がアップします。
あと、PADSは水に強いらしくって、1,200 ppmの水を加えて硫化を行なってもリン酸エステル(PO)は副生しないそうです。
Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 2007, 26:181-199.
Org. Proc. Res. Dev., 2004, 8, 852-858.

ところで、PS型のSオリゴの合成ではキャッピングを硫化の後に行うのが必須ですが、PO型の普通のオリゴの場合はどうなんでしょか?
教科書や殆どの試薬メーカーとかのサイトには、"カップリング→キャッピング→酸化"の順番で記載されているのでこれがゴールデン・スタンダードなのかと思いきや、オリゴヌクレオチド自動合成装置メーカーのYouTube動画では"カップリング→キャッピング→酸化"の順になっています。


PO型の普通のオリゴ核酸合成では、キャッピングと酸化の順番はクリティカルではないのか?それとも、最近では"酸化→キャッピング"の順番にアップデートされているのか?

今度Cytivaの人に会ったら聞いてみようと思う二流大出のテクニシャン(研究補助員)のホスホロアミダイト法メモでした。

2024年1月25日木曜日

イオン交換クロマトグラフィーの世界へようこそ。

やっぱり居酒屋大好きコンキチです。
日本堤にあるお店で一杯やったときのメモです。

-丸千葉 memo-
住所:台東区日本堤1-1-3

-大ビール (650 JPY, visited Aug. 2019)-
サッポロ、アサヒ、キリンから選べる。
赤星をセレクト。

-しめさば (600 JPY, visited Aug. 2019)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
やんわり薫る優しいお酢の匂い。
軟らかく、しなやかで可愛らしい食感。 
脂々してないピュアーで綺麗な脂。 
今まで食べた”しめさば”の中で一番旨いかも。 
お醤油はキリッと締まった香味豊かなしっかりした綺麗な辛口。 何も付けずに食べて凄く美味しいピュアーな味。 お醤油をちょっとがけチョンっていう感じで付けて食べると、お酢のニュアンスがアップすると共に、鯖の味に深みが出て良いです。 
あと、大葉の香味豊か。


-かつ煮 (700 JPY, visited Aug. 2019)- 
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
衣はカリッと軽やか。柔らかい良い匂いの出汁を吸って軟らかくなった部分(衣)も旨く、両者にコントラストも楽しい。 
かつはソリッドな部分がメインで、しっかり噛み締めて食べるタイプ。淡白で美味しい。 
それから玉子の少しだけトロッとした食感が素晴らしく絶妙。 
あと、お出汁を擦った玉葱のシャックとした食感が良いです。 


-にごり酒 (330 JPY, visited Aug. 2019)-
-RATING- ★★★★☆
-REVIEW-
ザラッとした舌触り。
そして、サラッとした甘さとけっこうシックな旨さ。 







-あさりぬた (500 JPY, visited Aug. 2019)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
ウェット感大で流動性の高い味噌ダレは、比較的スレンダーな甘さ。 
あさりは身がプリプリで気持ちいい弾力。
そして、味が濃い!ジューシー!
 肉厚の葱はとってもフレッシュなんだけど、ちょっと硬いのが少し気になる。 
で、あさりと葱のコンボが最高のマリアージュ。 


-日本盛 徳利 小 (350 JPY, visited Aug. 2019)- 
熱燗にしてもらう。 


-うなぎきも 2本 (450 JPY, visited Aug. 2019)- 
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
ブリンプリンな食感と滋味深いフィッシーフレーバー(fishy flavor)がとてもいい感じ。そして、強烈に苦み走っている(ガツンときてこれが堪らない)。 
タレは締まった甘さと、キリッとしたお醤油系のしっかりとしたボディの落ち着いた味で旨い。
日本酒に合わせて最高。 


-牛もつにこみ (550 JPY, visited Mar. 2020)-
-RATING- ★★★★★ 
-REVIEW-
これはとっても旨い!
 滋味深く、旨味リッチなお醤油仕立て。 
モツはとても軟らかく、適度な(心地よい)噛み心地。 味も良く染み込んでいる。 
もつ以外の具は、蒟蒻、牛蒡(?)、絹豆腐で、ツユの染み込み具合は軽微。 
東京五大煮込みに勝るとも劣らない旨さ。 


-ハムカツ(1)、カキフライ(1)、アジフライ(1) (visited Mar. 2020)- 
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
ハムカツ(500 JPY)を注文したら、お姉さんに「(ハムカツだけ)4枚になっちゃいますけど、他のと変えられますけど」と言われたので変更してもらったです。
油のいい匂いがして、軽やかに揚げられている。サクサクの衣は油の重さを全く感じない。 
ハムカツはしとりしたハムの旨さ。 
カキは香味強いくこれはポイント高い)。、プルプルの食感。
アジはふっくらとした身で、これもとても旨い。 
とってもアツアツで提供され、衣もイガイガしてなくて良いです。
味付けは、ブルドックの中濃ソース、タルタルソース、カラシ、レモン。 
つけ合わせは、トマト、山芋、ブロッコリー、キャベツ 。


-ケンビシ (550 JPY, visited Mar. 2020)-
雪冷え~花冷えくらい。
豊潤系でいいネ。 


-いかしおから (250 JPY, visited Mar. 2020)-
-RATING- ★★☆☆☆
-REVIEW-
意外と普通。
フレッシュ感をそれ程感じず。 
酒粕感ある。
甘辛仕立て。 


 

-なの花からしあへ (350 JPY, visited Mar. 2020)-
-RATING- ★★★★☆
-REVIEW-
菜の花は茎が太めでフレッシュ。なので、食感がダイナミック。
塩味控えめで、カラシはピリッと丁度いい按配。
トップに戴くかつおぶしが香味豊かで、全体の味を一段高いところに押し上げる。 




 
-大ビール (700 JPY, visited Oct. 2023)-
やっぱり赤星をセレクト。
やっぱ、値上がりしてるです。









-くじらさしみ (800 JPY, visited Oct. 2023)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
冷凍だと思うけど、食感最高。
軟らかくてピュリュっとした形のある食感。
薬味なしでそのまま食べると、僅かに野趣的な味わい。それでいて、ピュアな滋味深さ。
薬味(ニンニク、生姜)を付けて食べると、クサミが消えてよりピュアな味わいに。美味。


-カキフライ (700 JPY, visited Oct. 2023)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
カキ(4)→カキ(2)、アジフライ(1)にしてもらったです。
油は軽やか。衣サクサク。
カキの身は滋味深い味。
アジはふっくらしていて味が濃い。
調味料は、レモン、からし、中濃ソース、タルタルソース。
何も付けずにそのまま食べて美味しいんだけど、調味料のどれを付けて食べても全部合う。


-ポテトサラダ (350 JPY, visited Oct. 2023)-
-RATING- ★★★☆☆
-REVIEW-
ポテサラの他に、カニカマ、ブロッコリー、玉葱の千切り、トマトなどが添えられていて賑やかで、普通に美味しい。





-菊正宗 (480 JPY, visited Oct. 2023)-
-REVIEW-
樽酒がグラスで出てくるのかと思ったら、こっちでした。
こいつは、けっこう甘いね。









-あさりぬた (500 JPY, visited Oct. 2023)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
あさりも、(多分)葉にんにきもたっぷり。
あさりは身がふっくらしていて美味しい。
(多分)葉にんにくは、軟らかく、ちょいゴワゴワな食感がいい(ちょっと水っぽいのはご愛嬌)。
酢味噌がマイルドで程良く甘くて美味しい。


-白ハイボール (480 JPY, visited Oct. 2023)-
-REVIEW-
所謂チューハイ。
プレーンな味わいで、レモンを浮かべてキリッ。







あと、ここのホール担当のマスターは、めっちゃ気さくでホスピタリティー大です。


閑話休題


流行ってるぜーオリゴ核酸。
核酸医薬品は従来の医薬品では標的にできなかったRNAをターゲットにできるのが大きなウリであり、今後の期待大と言われています。 
2020年のマーケットサイズは0.5兆円と各種モダリティ中で最弱ですが、市場は急拡大中で、2030年まで年率約17%と他の創薬モダリティに比して高い成長が見込まれています。
(因みに、他の医薬品の市場規模は、ペプチド医薬品: 3.2兆円、抗体医薬品:16兆円、低分子医薬品:48兆円、タンパク質医薬品: 6.4兆円)。

そんなこんなで、核酸医薬品のCDMO分野は日系の化学メーカーの進出が近年加速しているそうですね。

日東電工:2011年にAvecia Biotechnology(現Nitto Denko Avecia)を数十億円規模で買収。核酸医薬品としては世界最大規模の製造拠点を米国に所有し、グローバルトップシェア。

味の素バイオファーマサービス:独自の液相合成技術AJIPHASE

住友化学:ガイドRNAの量産技術を確立。

といった具合です。

最近ではSYNCREST(https://www.syncrest.com)という一見外資系かと見紛う名前だけど、大塚化学と横河電機が昨年設立したジョイントベンチャーもオリゴ核酸のCDMO事業に参入しています。

ハイこんな感じで、お金の匂いがするからか、核酸医薬品はイケイケの様相を呈しています。ちょっとカッコよく言うと、群雄割拠なんじゃないでしょうか?(知らんけど)

ところで、一昔前のオリゴ核酸関連論文を読むと、精製は逆相クロマトグラフィーが主流でイオン交換クロマトグラフィーは分析ユースのオプション的な感じで記述されていましたが、今では実製造の精製はほぼほぼ陰イオン交換クロマトで行っているという話を聞きます。何でも、逆相の5-6倍程度のせれることが出来て効率が良いとか。

ということで、オリゴ核酸の分離・精製に威力を発揮する、おそらく多くの有機合成化学者には馴染みの薄い陰イオン交換クロマトグラフィーについてメモしてみようと思います。

まず分離のメカニズムですが、イオン交換クロマトグラフィーは電荷の違いを利用した成分の分離法で、固定相に吸着させたイオン性の化合物を移動相の塩濃度を上げてやることで溶出させていくのが基本です。所謂、塩グラジエントですね。島津やCytivaのウェブサイトが分かりやすいと思うのでリンクを貼っておきます↓

電荷の違いが基本の分離モードなので、オリゴ核酸の陰イオン交換クロマトグラフィー における主な分離メカニズムは、核酸そのものの長さによるチャージ、すなわちリン酸基の数になります。リン酸基の分だけバリバリに負電荷があるので、鎖長が違えばリン酸基の数も異なりその分だけ電荷が異なるので陰イオン交換クロマトグラフィーによる分離が有効になるのでしょう。

一般的に固定相には四級アンモニウム塩が使用され、緩衝液にはNaOH水溶液やTris・HCl水溶液、溶出に使う塩はNaClやNaClO4が一般的なんじゃないかと思います。

それでは以下に、グーグル先生に教えてもらったオリゴ核酸に特化した分離Tipsを具体的にメモっていきます。

a) ポアサイズ:数個-200塩基 は1000Å 、それ以上(例えば数千塩基) は4000Åが有効。
ただ、ノンポーラスの方が拡散が少なくなのでピークがシャープになると言いますね(分析ユースで有効と聞きます)。逆に分取では負荷量を稼げるポーラスカラムが効率良い。
b) 溶出力:NaClO4はNaClの2-3倍大きい。
c)  PS型はPO型よりも酸性が高いため、アニオン交換モードでの保持が大きくなる。
d) 高pH条件で、S化オリゴ(PS型)と酸化不純物(PO型)の分離がよくなる。
e)  pH 11-12 の NaOH により二次構造が壊れ、シャープなピークを得られる。
f) 昇温により二次構造が壊れ、シャープなピークを得られる。
g) RNAはNaOH系での分解に注意。高pHと高温を組み合わせは特に危険。

h) オリゴヌクレオチドの鎖長が長くなるほど負電荷が増加し、効率的に溶出するためにより高い塩濃度、より高い pH が必要にある場合がる。
i) 緩衝液は20 mM Tris・HCl (pH 8.1)より、10 mM NaOHにてオリゴヌクレオチドのピークが良好。 
j) カウンターイオンとして使用する塩は、NaClよりNaClO4を用いる方がピークテーリングが抑えられる。 
k)  移動相のpHが8未満の場合、核酸はそれぞ れ一つずつチャージを持ち、これに伴い核酸の全体的なチャージも増え、陰イオン交換による保持が強くなる。
l) 移動相のpHが8から11.5になると、GとT(RNAの場合はU)に結合している互変異性の酸素がオキソアニオンになるため、GとT(U)の含有量に比例して チャージがさらに増加し保持が強くなる。


とえあえず、今回Google先生に教えてもらったことは以上です。
っていうか、CytivaとかAgilentとかYMCとかのサイトに書いてあったんですけどね。

どうですが、あなたも明日からオリゴ核酸CDMO企業でイオン交換クロマト使ってバリバリ分析したくなりませんか?

と言いつつ、オリゴ核酸CDMOはアグレッシブ過ぎる気がするんでボクは勘弁と思う二流大出のテクニシャン(研究補助員)の、イオン交換クロマトメモでした。